非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占肺癌病例的85%，是肺癌領(lǐng)域的“致命挑戰(zhàn)”，因早期診斷困難、晚期耐藥頻發(fā)導(dǎo)致患者5年生存率長(zhǎng)期處于低位；盡管靶向治療、免疫治療等療法不斷進(jìn)階，但腫瘤異質(zhì)性引發(fā)的療效差異、耐藥反復(fù)等問(wèn)題，仍使臨床對(duì)新型治療機(jī)制與藥物需求迫切。而MicroRNA（miRNA）作為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵分子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演“分子開(kāi)關(guān)”角色，其中miR-145-5p是公認(rèn)的抑癌miRNA，可通過(guò)靶向致癌基因抑制NSCLC細(xì)胞增殖，卻因在腫瘤微環(huán)境中易被降解、穩(wěn)定性不足嚴(yán)重限制功能發(fā)揮，因此如何保護(hù)這類(lèi)抑癌miRNA的活性，成為肺癌研究的新突破口。

今天和大家分享一篇關(guān)于聚焦天然產(chǎn)物欖香烯（Elemene）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）治療中作用機(jī)制研究的文章，該文章于2024年10月發(fā)表在J Pharm Anal雜志上，標(biāo)題為“Elemene as a binding stabilizer of microRNA-145-5p suppresses the growth of non-small cell lung cancer”。

01. 研究思路

本文圍繞“闡明欖香烯抗非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的分子機(jī)制”展開(kāi)：首先，通過(guò)患者來(lái)源異種移植（PDX）模型、細(xì)胞來(lái)源異種移植（CDX）模型，結(jié)合A549、H460等細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot等技術(shù)，證實(shí)欖香烯可抑制NSCLC生長(zhǎng)，并鎖定NF-κB炎癥通路為核心作用通路；其次，借助高通量miRNA測(cè)序技術(shù)篩選差異表達(dá)miRNA，結(jié)合OncomiR、dbDEMC等數(shù)據(jù)庫(kù)交叉驗(yàn)證，再通過(guò)qRT-PCR、Northern blot技術(shù)驗(yàn)證，確定miR-145-5p是介導(dǎo)欖香烯作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)；接著，利用miRTarBase、TargetScan等生物信息學(xué)工具篩選靶基因，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-145-5p直接結(jié)合MAP3K3的3'-UTR，再以Western blot、qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證二者的調(diào)控關(guān)系及對(duì)NF-κB通路的影響；隨后，采用qRT-PCR、Northern blot、放線菌素D實(shí)驗(yàn)明確欖香烯通過(guò)抑制miR-145-5p降解（而非影響其合成）來(lái)提高其穩(wěn)定性，通過(guò)微量熱泳動(dòng)（MST）技術(shù)測(cè)定結(jié)合親和力（KD=0.39±0.17 μg/mL），結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)闡明欖香烯結(jié)合miR-145-5p 3' 端胞嘧啶的作用模式；最后，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)構(gòu)建miR-145-5p過(guò)表達(dá) / 敲低的穩(wěn)定細(xì)胞系，開(kāi)展體內(nèi)外rescue實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合免疫組化（IHC）技術(shù)，驗(yàn)證“欖香烯→miR-145-5p→MAP3K3→NF-κB”通路的特異性。全程以多維度技術(shù)手段系統(tǒng)揭示了欖香烯抗NSCLC的分子機(jī)制，為天然產(chǎn)物靶向miRNA的藥物研發(fā)提供了新思路。

02. 主要研究?jī)?nèi)容

（1）欖香烯體外抑制非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞增殖

為明確欖香烯對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的體外作用機(jī)制，研究以A549、H460 等細(xì)胞系為對(duì)象，經(jīng)不同濃度欖香烯處理后，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)到細(xì)胞活力呈劑量依賴性顯著下降，菌落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖（菌落數(shù)量與體積減少）。借助流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Western blot，發(fā)現(xiàn)欖香烯可誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期阻滯（S期相關(guān)蛋白表達(dá)降低）；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（Annexin V-FITC/PI雙染色） 和免疫熒光成像，證實(shí)其提高凋亡率并觸發(fā)細(xì)胞色素C釋放，且Western blot檢測(cè)到促凋亡蛋白上調(diào)、抗凋亡蛋白下調(diào)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)與Western blot表明，欖香烯能抑制細(xì)胞遷移（遷移相關(guān)蛋白表達(dá)降低）。為驗(yàn)證通路參與，Western blot顯示其降低IKKα/β、IκBα磷酸化水平，免疫熒光成像與Western blot證實(shí)抑制p65/p50核轉(zhuǎn)位，GST pull-down和ChIP實(shí)驗(yàn)表明其減少p65/p50與COX-2啟動(dòng)子結(jié)合，最終Western blot檢測(cè)到NF-κB下游炎癥因子表達(dá)降低。綜上，多技術(shù)協(xié)同證實(shí)欖香烯通過(guò)抑制增殖遷移、誘導(dǎo)周期阻滯與凋亡、調(diào)控NF-κB通路，顯著抑制NSCLC細(xì)胞進(jìn)展。

（2）欖香烯通過(guò)一種依賴于調(diào)控miR-145-5p的機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用

通過(guò)Western blot分析和qRT-PCR在細(xì)胞來(lái)源異種移植（CDX）模型、患者來(lái)源異種移植（PDX）模型及A549細(xì)胞系中證實(shí)其顯著抑制MAP3K3的蛋白和mRNA 表達(dá)，再借助雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blot分析明確miR-145-5p可顯著干擾欖香烯對(duì)MAP3K3的調(diào)控作用，通過(guò)菌落形成實(shí)驗(yàn)觀察到miR-145-5p水平降低時(shí)，欖香烯誘導(dǎo)的菌落形成能力下降現(xiàn)象被部分逆轉(zhuǎn)，證實(shí)欖香烯對(duì)體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制依賴于miR-145-5p，提示其通過(guò)調(diào)控miR-145-5p/MAP3K3/NF-κB信號(hào)軸發(fā)揮抗癌作用；后續(xù)通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建（表達(dá)LV-anti-miR-145-5p或 LV-anti-miR-NC），在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建NSCLC模型，發(fā)現(xiàn)miR-145-5p敲低組中欖香烯的抗腫瘤效能顯著降低，再經(jīng)Western blot分析檢測(cè)到體內(nèi)敲低miR-145-5p可緩解 MAP3K3表達(dá)降低、提高NF-κB信號(hào)通路活性并逆轉(zhuǎn)欖香烯對(duì)COX-2、IL-6、TNF-α 等蛋白的下調(diào)作用，最終通過(guò)免疫組化（IHC）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述結(jié)論，明確欖香烯抑制非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）進(jìn)展的作用至少部分由miR-145-5p介導(dǎo)。

(3) 欖香烯通過(guò)阻斷miR-145-5p的降解來(lái)增加其豐度

欖香烯通過(guò)直接結(jié)合miR-145-5p阻斷其降解，進(jìn)而增加該miRNA的豐度：首先借助qRT-PCR技術(shù)分析欖香烯處理后成熟miR-145-5p及其前體（pri-/pre-miR-145-5p）的濃度，證實(shí)其僅顯著提高成熟miR-145-5p的豐度；隨后通過(guò)Northern blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，明確欖香烯僅特異性升高成熟miR-145-5p水平，對(duì)其前體無(wú)影響，從而排除了通過(guò)調(diào)控生物合成增加豐度的可能性。為明確欖香烯對(duì)miR-145-5p的降解抑制作用，在RNA合成抑制劑放線菌素D存在的條件下進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)欖香烯能有效阻斷miR-145-5p的降解。細(xì)胞裂解物共孵育實(shí)驗(yàn)顯示，預(yù)先與欖香烯孵育的miR-145-5p降解程度顯著降低，但miR-145-5p與經(jīng)欖香烯預(yù)處理的細(xì)胞裂解物共孵育時(shí)，降解無(wú)明顯變化，這表明欖香烯是通過(guò)直接結(jié)合miR-145-5p發(fā)揮穩(wěn)定作用，而非抑制RNA降解酶的活性。進(jìn)一步通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)模擬二者相互作用，發(fā)現(xiàn)欖香烯優(yōu)先結(jié)合miR-145-5p的3'端，通過(guò)非極性范德華力與該區(qū)域 C20?C22位的胞嘧啶結(jié)合。最后，微量熱泳動(dòng)（MST）技術(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，野生型 miR-145-5p與欖香烯的解離常數(shù)（KD=0.39±0.17 μg/mL）遠(yuǎn)低于突變體。綜上，欖香烯在不改變miR-145-5p生物合成途徑的前提下，通過(guò)直接結(jié)合增強(qiáng)其穩(wěn)定性，最終實(shí)現(xiàn)miR-145-5p豐度的增加。

03. 參考文獻(xiàn)

Zhou MR, Wang JY, Peng YL, et al. Elemene as a binding stabilizer of microRNA-145-5p suppresses the growth of non-small cell lung cancer. J Pharm Anal. 2024, 15(3):101118. Doi: doi.org/10.1016/j.jpha.2024.101118