肝細(xì)胞癌（HCC）是全球范圍內(nèi)惡性程度極高的腫瘤之一，腫瘤代謝重編程是其惡性進(jìn)展的核心驅(qū)動(dòng)力，其中缺氧誘導(dǎo)因子- 1α（HIF-1α）介導(dǎo)的糖代謝異常亢進(jìn)，為肝癌細(xì)胞快速增殖、適應(yīng)腫瘤微環(huán)境提供了關(guān)鍵能量支撐。HIF-1α的活性與β- 連環(huán)蛋白（β-catenin）通路密切關(guān)聯(lián)，而ICAT作為β-catenin的天然抑制因子，其與 β-catenin的相互作用平衡直接調(diào)控通路活性，進(jìn)而深刻影響HIF-1α介導(dǎo)的糖代謝網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)前肝癌治療仍面臨耐藥、復(fù)發(fā)率高等難題，針對(duì)代謝關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的精準(zhǔn)干預(yù)成為突破治療瓶頸的迫切需求。

今天和大家分享一篇關(guān)于鴉膽子素D（Bruceine D）通過阻斷ICAT/β-catenin相互作用，抑制肝細(xì)胞癌中HIF-1α介導(dǎo)的糖代謝的研究文章。該文章于2021年5月發(fā)表在Acta Pharm Sin B雜志上，標(biāo)題為“Bruceine D inhibits HIF-1α-mediated glucose metabolism in hepatocellular carcinoma by blocking ICAT/β-catenin interaction”。

01. 研究思路

本研究針對(duì)肝細(xì)胞癌（HCC）缺氧微環(huán)境下HIF-1α介導(dǎo)糖代謝重編程的臨床難題，以天然產(chǎn)物鴉膽子素D（BD）為研究工具，先通過CCK-8、活死細(xì)胞染色等表型技術(shù)明確其對(duì)HCC細(xì)胞增殖及HIF-1α的特異性抑制，再借助Seahorse細(xì)胞能量代謝分析、糖攝取/乳酸檢測(cè)等技術(shù)解析BD對(duì)HIF-1α介導(dǎo)糖代謝重編程的抑制效應(yīng)；繼而運(yùn)用DARTS、CETSA等技術(shù)篩選并聚焦靶點(diǎn)ICAT，結(jié)合MST和分子對(duì)接技術(shù)直接驗(yàn)證BD與ICAT的結(jié)合及關(guān)鍵作用位點(diǎn)；隨后通過敲低ICAT、Co-IP等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，闡明 BD結(jié)合ICAT后破壞其與β-catenin的相互作用、促進(jìn)β-catenin降解進(jìn)而抑制HIF-1α 合成的調(diào)控鏈，且敲低ICAT的反向驗(yàn)證進(jìn)一步夯實(shí)ICAT的核心功能；最終借助 Huh7裸鼠移植瘤模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合瘤內(nèi)蛋白表達(dá)檢測(cè)、組織學(xué)分析等技術(shù)閉環(huán)驗(yàn)證機(jī)制，全程以DARTS、CETSA、MST等生物物理技術(shù)和Seahorse代謝分析為核心技術(shù)支撐，完整揭示BD通過“ICAT→β-catenin→HIF-1α”軸調(diào)控HCC代謝重編程的分子邏輯，為HCC代謝靶向治療提供了技術(shù)驅(qū)動(dòng)的機(jī)制創(chuàng)新與藥物研發(fā)方向。

02. 主要研究?jī)?nèi)容

（1）ICAT是BD的直接靶點(diǎn)

為探究BD調(diào)控HIF-1α的分子靶點(diǎn)，本研究基于“小分子結(jié)合蛋白在蛋白水解過程中會(huì)被保護(hù)并富集”的原理，采用DARTS結(jié)合質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略篩選潛在直接結(jié)合蛋白，結(jié)合BD可抑制β-catenin及HCC中β-catenin與HIF-1α表達(dá)正相關(guān)的背景，優(yōu)先聚焦β-catenin信號(hào)抑制因子ICAT；隨后通過CETSA證實(shí)，100 μmol/L BD 可提升HepG2、Huh7細(xì)胞中ICAT的熱穩(wěn)定性；為明確結(jié)合類型與位點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜分析排除BD與ICAT的共價(jià)結(jié)合后，通過分子對(duì)接預(yù)測(cè)到BD與ICAT的Lys28形成氫鍵，并與Leu24、Leu52、Met25存在疏水作用，進(jìn)一步采用MST直接測(cè)定BD與野生型 ICAT的結(jié)合親和力（Kd≈33 μmol/L），且通過定點(diǎn)突變構(gòu)建Lys28突變體后，MST顯示其結(jié)合親和力顯著降低（Kd≈250 μmol/L），最終從技術(shù)層面完整驗(yàn)證ICAT是BD 的直接靶點(diǎn)，且Lys28為關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。

（2）BD靶向ICAT干擾β-catenin/HIF-1α軸抑制HCC糖代謝的機(jī)制

研究通過ICAT小干擾RNA（si-ICAT）敲低HepG2和Huh7細(xì)胞中的ICAT，發(fā)現(xiàn)其可顯著逆轉(zhuǎn)BD對(duì)HIF-1α及下游糖酵解相關(guān)蛋白（LDHA、GLUT1/3、HK2、PKM2）的抑制作用，同時(shí)緩解BD對(duì)HCC細(xì)胞糖攝取和L - 乳酸生成的抑制，證實(shí) ICAT是BD調(diào)控β-catenin/HIF-1α通路及糖代謝的關(guān)鍵靶點(diǎn)。已知ICAT可阻斷β-catenin與TCF/LEF結(jié)合，還能通過競(jìng)爭(zhēng)APC結(jié)合位點(diǎn)穩(wěn)定β-catenin。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，BD在缺氧條件下劑量依賴性抑制β-catenin表達(dá)，且蛋白酶體抑制劑MG-132可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)，提示BD通過蛋白酶體依賴途徑降解β-catenin。免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BD可減弱ICAT過表達(dá)細(xì)胞中β-catenin與ICAT的直接結(jié)合，且β-catenin 敲低后HIF-1α表達(dá)顯著降低。為明確BD抑制HIF-1α的機(jī)制，MG-132處理顯示BD 可阻斷HIF-1α積累，蛋白翻譯抑制劑CHX表明BD不影響其降解速率，qRT-PCR證實(shí)HIF-1α mRNA水平無變化，說明BD通過抑制其蛋白翻譯發(fā)揮作用。綜上，BD直接靶向ICAT，干擾其與β-catenin的相互作用并促進(jìn)后者降解，進(jìn)而調(diào)控HIF-1α表達(dá)，為其抑制HCC糖代謝的機(jī)制提供了關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

（3）BD抑制異種移植瘤的生長(zhǎng)

為評(píng)估BD的體內(nèi)抗腫瘤活性，本研究構(gòu)建Huh7細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，以 0.75 mg/kg/天和1.5 mg/kg/天的劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行連續(xù)兩周尾靜脈注射給藥。結(jié)果顯示，1.5 mg/kg/天的BD處理組可顯著抑制移植瘤生長(zhǎng)，且所有給藥組小鼠均未出現(xiàn)明顯體重下降及副作用。對(duì)腫瘤組織的病理與免疫組織化學(xué)分析表明，1.5 mg/kg/天的BD處理可使腫瘤壞死面積顯著增加、TUNEL陽性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）增多，同時(shí)減少Ki67陽性細(xì)胞（增殖細(xì)胞）。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，BD處理后瘤組織中HIF-1α、β-catenin、GLUT1/3、LDHA、ICAT及Cyt c的蛋白水平均顯著下調(diào)，進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證了BD通過調(diào)控“ICAT→β-catenin→HIF-1α”軸抑制HCC進(jìn)展的作用。

03. 參考文獻(xiàn)

Huang R, Zhang LJ, Jin JM, et al. Bruceine D inhibits HIF-1α-mediated glucose metabolism in hepatocellular carcinoma by blocking ICAT/β-catenin interaction. Acta Pharm Sin B. 2021, 11(11):3481–3492. doi: 10.1016/j.apsb.2021.05.009